Tratamiento de la infección tuberculosa latente con RUTI

El desarrollo de la LTBI se relaciona con la capacidad de M. tuberculosis de crecer lentamente, de provocar la formación de necrosis a los tejidos que infecta, para desarrollar resistencia al estrés, y para reactivar constantmenet, induyendo constantmente lesiones nuevas para poder hacer frente al rápido recambio celular en los pulmones. La inmunoterapia con RUTI se basa en la prevención de la ausencia transitoria de inmunidad generada después de un tratamiento quimioterápico de corta duración, que permite la reactivación del bacilo latente, y por lo tanto permite que este tratamiento corto se pueda llevar a cabo.


2.-El orígen del bacilo latente

Al inicio de la infección por M. tuberculosis, el desarrollo de la necrosis intragranulomtosa en la mayoría de los mamíferos infectados sugiere el desarrollo del fenomen de Koch [4]. Este fenómeno probablemente surge como consecuencia de una reacción de Schwartzman local [5], causando la “primera onda” de bacilos latentes (es decir, aquellos que sobreviven la respuesta inflamatoria inicial), que quedan atrapados en les fibras de colágeno que ocupan el espacio desocupado por los macrófagos infectados destruidos. Posteriormente, la respuesta inmune específica genera la “segunda ola” de bacilos latentes, mediante la activación de los macrófagos infectados que destruyen la mayor parte de la carga bacilar.
Concretamente en el modelo de tuberculosis experimental en ratones, esta destrucción significa el 90% de los bacilos. Esta destrucción es ocasionada mayoritariamente por células T específicas [6] que desencadenen una serie de mecanismos capaces de destruir la mayoría de las bacterias (como la disminución del pH o la generación de radicales de oxígeno o nitrógeno). Como consecuencia de esta respuesta inmune fuerte, la población bacilar en la fase crónica la conforman bacilos capaces de adaptarse a este estrés, convirtiéndose en bacilos latentes.


3.-Papel de los macrófagos espumosos en la inmunodepresión local y la diseminación bacilar constante

En la fase crónica aparecen unas células nuevas, que ocupan los espacios alveolares, formando el anillo externo del granuloma. Son los macrófagos espumosos (ME) [7]. Tal como ha sido revisado recientemente[8], algunos de estos ME contienen bacilos aislados que son transportados al exterior del granuloma, donde finalmente se multiplicarán y acabarán destruyendo el ME, permitiendo una gran diseminación bacilar a través de los espacios alveolares. Este hecho explica por qué no toda la población bacilar en la fase crónica está en estado latente. Igualmente, dado que los ME producen óxido nítrico (NO) y pueden suprimir las células T específicas, tanto de tipo Th1 como Th2, las ME generan un anillo exterior inmunosupresor alrededor del granuloma.


4.-La naturaleza dinámica de la ITBL y la importancia de la quimioterapia de corta duración en su tratamiento

Es difícil de entender por qué hace falta la administración de isoniazida durante 9 mesos para tratar la ITBL. Dado que los bacilos latentes no son susceptibles a esta droga, por qué hace falta administrarla durante un período de tiempo tan largo? En primer lugar la respuesta es ue de esta manera se destruyen los bacilos que se están multiplicando activamente, y que se pueden encontrar en la fase inicial; y posteriormente, para prevenir la reactivació de qualquier bacilo latente que trate de multiplicarse, permitiendo que los mismos macrófagos, siguiendo su dinámica habitual los drenen hacia el exterior del parénquima pulmonar.
Mediante la reducción de la respuesta inflamatoria y previniendo la multiplicación de los bacilos, la quimioterapia también para la formación contínua de ME y su acumulación en los espacios intraalveolares, eliminando el anillo inmunodepresor situado en la parte más externa del granuloma. Igualmente también reduc la posibilidad de generar una respuesta tóxica de tipo Koch a la hora de administrar la vacunación terapéutica. Por otro lado, la administración de quimioterapia indce una inmunodepresión por sí misma y permite la reactivación de bacilos latentes locales en finalizar su administración [9]. Este hecho también explica porqué hay que administrar tanto tiempo la quimioterapia.


5.-El orígen de RUTI

El diseño de RUTI surge para superar la inmunodepresión generada por una quimioterapia de corta duración contra LTBI (Figura 1). RUTI es capaz de reestimular la inmunidad preexistente, mayoritariamente centrada contra los bacilos en crecimiento, así como iniciando una respuesta contra antígenos estructurales o inducidos por estrés, presentes en los bacilos latentes.
El proceso de fabricación de RUTI fue publicad recientmente [10]. Actualmente Archivel Farma s.l. (Mataró) lo fabrica en condiciones de Buenas Prácticas de Manufactura (BPMs). El proceso implica el cultivo de M. tuberculosis durante 3 semanas en agar Middlebrook 7H11, a 37ºC bajo una atmosfera progresiva de disminución en el pH i pO2. Una vez se obtienen las colonias, se fragmentan mecánicamente utilizando bolas de sílica-zirconio en PBS con un 4% de Tritón X-114. Después de una leve centrifugación a 3000 g para sacar las células enteras, el pelet se centrifuga a 27.000 g, extrayéndose el sobrenedante. Después del lavado, el pelet se pasteuriza a 65ºC durante 40 minutos, i se liposoma. La composición peptídica de RUTI se determina utilizando SDS-PAGE, y el patrón se obtiene mediante western blot, tal como se ha descrito previamente [10].


6.- Mecanismos de protección y efectividad de RUTI

La inoculación de RUTI en ratones infectados y tratados durante un período corto de quimioterapia induce una fuerte respuesta inmune de tipo Th1/Th2/Th3 contra 13 antígenos de M. tuberculosis, que permite una fuerte acumulación (de hasta 10 veces) de células T PPD-específicas de tipo CD4 i CD8 en el pulmón infectado, en comparación con aquellos animales unicamente tratados con quimioterapia (Figura 2)[8]. Hace falta remarcar que la inmunoterapia con BCG sólo consigue incrementar significativamente el reclutamiento de células T CD4.
Por otro lado, la serumterapia pasiva con anticuerpos policlonales obtenidos a partir de ratones tractados durante un corto período de quimioterapia y RUTI, era capaz de controlar la reactivación de ratones SCID tractados durante un corto período de quimioterapia (Figura 3), demostrando el papel protector de la respuesta humoral generada por RUTI [12].

La eficacia de RUTI se ha podido demostrar en una amplia gama de cepas de ratones. Algunos de estos experimentos ya estan publicados [11]. La Figura 4 muestra un experimento estándard, reflejando no tan sólo el control de la reactivación, sinó el efecto bactericida inducido por la inmunoterapia con RUTI. Este efecto se ha podido demostrar también con cobayas, tal como se aprecia en la Figura 5. En este modelo es especialmente difícil reflejar el efecto bactericida, dado que los cobayas tienen un mejor control de la concentración bacilar que los ratones.
Los experimentos de larga evolución (24 setmanes de evolución) no muestran diferencias en cuanto a les concentraciones bacilares, en comparación con los controles. En este caso las diferencias se obtienen cuando a la supervivencia de los animales y el grado de severidad de la patología pulmonar, que se controla mejor en los animales tratados con RUTI.

Este efecto también se demostró en cabras naturalmente infectadas con M.bovis (Figura 6) (no publicado). Datos obtenidos a partir de un estudio de campo hicieron reflejar este beneficio en los animales tratados con RUTI.
En estos animales, la quimioterapia de corta duración reducía dramáticamente la afectación pulmonar y extrapulmonar. La combinación de este tratamiento con la inoculación de RUTI también provocó la disminución de la patología en los nódulos limfáticos hiliares, algo primordial en el tratamiento de la LTBI humana (Figura 7).
Además, la inmunoterapia con RUTI indujo el aumento de IFN-g en sangre periférica post-estimulación ex-vivo con ESAT-6, PPD-bovino y RUTI (Figura 8). La inoculación de RUTI indujor un aumento transitorio de la temperatura rectal (1ºC, 24 hores después de la inoculación) y una tumefacción local como consecuencia de una reacción granulomatosa. No hubo ni toxicidad sistémica ni mortalidad inducida por la inoculación de RUTI. El cultivo de las muestras de los nódulos linfáticos hiliares demostró un promedio de 2 log10 CFUs en todos los grupos experimentales.


7.- Conclusiones

Una vez demostrada la utilidad de RUTI en el control del bacilo latente en los ensayos preclínicos (incluyendo la ausencia de toxicidad en el tratamiento), se ha iniciado un desarrollo clínico con la finalidad de demostrar la utilidad de reducir el tratamiento de la LTBI de 9 a 1 mes añadiendo a la vacunación terapéutica con RUTI al final. El ensayo de fase 1 se inciará a finales del año 2006.


REFERENCIAS

1. World Health Organization. Global Tuberculosis Control. WHO Report 2001. Geneva, Switzerland, WHO/CDS/TB/2001.287.
2. Mitchison DA. Basic mechanisms of chemotherapy. Chest 1979; 76S; 771-775S.
3. Grosset J. Bacteriologic basis of short-course chemotherapy for tuberculosis. Clin Chest Med 1980; 1: 231-241.
4. Thoen CO. Tuberculosis in wild and domestic mammals In: Tuberculosis Pathogenesis protection and control Bloom BR. (Ed.). ASM Press Washington DC 1994;11:157-164.
5. Cardona PJ, Llatjós R, Gordillo S,Viñado B, Díaz J, Ariza A, Ausina V, Towards a “human-like” model of tuberculosis: Local inoculation of LPS in lungs of Mycobacterium tuberculosis aerogenically infected mice induces intragranulomatous necrosis. Scand J Immunol 2001; 53: 65-71.
6. North RJ & Jung YJ. Immunity to tuberculosis Annu Rev Immunol 2004;22:599-623
7. Cardona PJ, Gordillo S, Díaz J, Tapia G, Amat I, Pallarés A, Vilaplana C, Ariza A, Ausina V Widespread bronchogenic dissemination makes DBA/2 mice more susceptible than C57BL/6 mice to experimental aerosol infection with Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun. 2003; 71 (10): 5845-5854.
8. Cardona PJ. RUTI: a new chance to shorten the treatment of latent tubeculosis infection. Tuberculosis (Edimb.). 2006. In Press.
9. Cardona PJ, Julian E, Gordillo S, Díaz J, Vallès X, Luquín M, Ausina V. Production of antibodies against glycolipids from the cell wall of M. tuberculosis in a murine model of tuberculosis. Scand J Immunol. 2002; 55: 639-645.
10. Cardona PJ, Amat I. Origin and Development of RUTI, a new therapeutic vaccine against Mycobacterium tuberculosis infection. Arch Bronconeumol 2006; 42:25-32.
11. Cardona PJ, Amat I, Gordillo S, Arcos V, Guirado E, Diaz J, Vilaplana C, Tapia G, Ausina V. Immunotherapy with fragmented Mycobacterium tuberculosis cells increases the effectiveness of chemotherapy against a chronical infection in a murine model of tuberculosis. Vaccine 2005; 23, 1393-1398.
12. Guirado E, Amat I, Gil O, Díaz J, Arcos V, Caceres N, Ausina V, Cardona PJ. Passive serum-therapy with polyclonal antibodies against Mycobacterium tuberculosis protects against post-chemotherapy relapse of tuberculosis infection in SCID mice. Microbes & Infection available online 27 january 2006.

Figure 1. Temporal strategy for the use of RUTI, indicating the effects of short-course chemotherapy and the requirements for subsequent immunotherapy.


Figure 2. Evolution of TCD4+ and TCD8+ IFNg+ cells, stimulated ex vivo with PPD, from lungs of infected mice treated with chemotherapy from weeks 6 to 14, and treated with 2 subcutaneous (s.c.) inoculations of RUTI (245 g) at weeks 14 and 17; 1 s.c. inoculation of BCG (10e6 CFUs) at week 14 or 1 s.c. of empty liposomes (control) -red, greeen and black symbols, respectively. The results are given as mean values with standard deviations obtained from 4 mice for each time point. Differences with control were significant when marked with * for p < 0.05 [8].



Figure 3. Control of CFUs after serum-therapy in the lung of SCID mice. After infection, mice were treated with INH+RIF from week 3 to 8 (in orange), and treated with 4 intraperitoneal (i.p.) inoculations of serum (hyperimmune serum, HS) from mice treated with short-period chemotherapy and RUTI (in red) or from normal non-infected mice (in black). The results are given as mean values with standard deviations obtained from 4 mice for each time point (apart from week 19, where 10 mice were treated with immune serum and 11 mice were given normal serum). Differences with control were significant when marked with * for p < 0.05. [12].



Figure 4. Bactericidal activity of RUTI in the lung of C57BL/6 mice. After infection, mice were treated with INH+RIF from week 9 to 17 (in orange), and with 3 subcutaneous (s.c.) inoculations of RUTI (185 g per inoculation) at weeks 17, 19 and 21 (in red) or empty liposomes (in black). The results are given as mean values with standard deviations obtained from 4 to 6 mice for each time point. Differences with control were significant when marked with * for p < 0.05 [11].



Figure 5. Bactericidal activity of RUTI in the lung of guinea pigs. After infection, animals were treated with INH+RIF from week 4 to 8 (in orange), and with 3 subcutaneous (s.c.) inoculations of RUTI (185 g per inoculation) at weeks 8, 10 and 14 (in red) or empty liposomes (in black).The results are given as mean values with standard deviations obtained from 8 animals for each time point. Differences with control were significant when marked with * for p < 0.05 [8].



Figure 6. Therapeutic diagram of the field study in M.bovis infected goats. Some of the animals were treated with isoniazid (300 mg intramuscular twice a week, in orange) and some of them received 2 inoculations of RUTI (271 g each). Peripheral blood was obtained at different time points to check the production of IFN-g after being stimulated ex vivo with different M. tuberculosis antigens.



Figure 7. Field study in M.bovis infected goats. Pathology scoring values (adapted from Vordermeier et al IAI 2002) reflects the control of the pathology induced by RUTI therapy in the hilar lymph nodes compared with the only chemotherapy treatment (Picture A). Chemotherapy treatment clearly induce a control of the infection, as reflected in the pathology scoring in pulmonary and extrapulmonary sites (Picture B).



Figure 8. Field study in M.bovis infected goats. Production of IFN-g after ex vivo stimulation of peripheral blood with ESAT-6. Picture A reflects individual monitoring of each animal. Picture B shows the ratios between weeks to check the tendency of the values (<1 decrease; >1 increase). Orange box shows the chemotherapy period and blue arrows RUTI inoculation.