Tractament de la infecció tuberculosa latent amb RUTI

El desenvolupament de la LTBI es relaciona amb la capacitat de M. tuberculosis per créixer lentament, per provocar la formació de necrosi als teixits que infecta, per desenvolupar resistència al estrès, i per reactivar constantment, induint constantment lesions noves per poder fer front al ràpid recanvi cel.lular als pulmons.
La immunoteràpia amb RUTI es basa en la prevenció de la manca transitòria d’immunitat local generada després d’un tractament quimioteràpic de curta duració, que permet la reactivació del bacil latent, i per tant permet que aquest tractament curt es pugui tirar endavant.


2.-L’origen del bacil latent

A l’inici de la infecció per M. tuberculosis, el desenvolupament de la necrosi intragranulomtosa en la majoria dels mamífers infectats suggereix el desenvolupament del fenomen de Koch [4]. Aquest fenomen probablement sorgeix com a conseqüència d’un reacció de Schwartzman local [5], causant la “primera onada” de bacils latents (és a dir, aquells que sobreviuen la resposta inflamatòria inicial), que queden atrapats en les fibres de col.làgena que ocupen l’espai desocupat pels macròfags infectats destruïts. Posteriorment, la resposta immune específica genera la “segona onada” de bacils latents, mitjançant l’activació dels macròfags infectats que destrueixen la major part de la càrrega bacil.lar. Concretament en el model de tuberculosi experimental en ratolins, aquesta destrucció significa el 90% dels bacils. Aquesta destrucció és ocasionada majoritàriament per cèl.lules T específiques [6] que desencadenen una sèrie de mecanismes capaços de destruir la majoria de les bactèries (com la disminució del pH o la generació de radicals d’oxigen o nitrogen). Com a conseqüència d’aquesta resposta immune forta, la població bacil.lar en la fase crònica la conformen bacils capaços d’adaptar-se a aquest estrès, convertint-se en bacils latents.


3.-Paper dels macròfags escumosos en la immunodepressió local i la disseminació bacil.lar constant

A la fase crònica hi apareixen unes cèl.lules noves, que ocupen els espais alveolars, conformant l’anell extern del granuloma. Són els macròfags escumosos (ME) [7]. Tal com s’ha revisat recentment [8], alguns d’aquests ME contenen bacils aïllats que són transportats a l’exterior del granuloma, on finalment es multiplicaran i acabaran destruint el ME, permetent una gran disseminació bacil.lar a través dels espais alveolars. Aquest fet explica perquè no tota la població bacil.lar a la fase crònica es en estat latent. Igualment, donat que els ME produeixen òxid nítric (NO) i poden suprimir les cèl.lules T específiques, tant de tipus Th1 com Th2, les ME generen un anell exterior immunosupressor al voltant del granuloma.


4.-La naturalesa dinàmica de la ITBL i la importància de la quimioteràpia de curta duració en el seu tractament

És difícil d’entendre perquè cal l’administració d’isoniazida durant 9 mesos per tractar la ITBL. Donat que els bacils latents no són susceptibles a aquesta droga, per què cal administrar-la durant un període de temps tan llarg? En primer lloc la resposta és que d’aquesta manera es destrueixen els bacils que s’estan multiplicant activament, i que es poden trobar en la fase inicial; i posteriorment, per prevenir la reactivació de qualsevol bacil latent que tracti de multiplicar-se, permetent que els mateixos macròfags, seguint la seva dinàmica habitual els drenin cap a l’exterior del parènquima pulmonar.
Mitjançant la reducció de la resposta inflamatòria i prevenint la multiplicació dels bacils, la quimioteràpia també atura la formació contínua de ME i la seva acumulació als espais intraalveolars, eliminant l’anell immunodepressor situat a la part més externa del granuloma. Igualment també redueix la possibilitat de generar una resposta tòxica de tipus Koch, a l’hora d’administrar la vacunació terapèutica.
Per un altre cantó, l’administració de quimioteràpia indueix una immunodepressió per si mateixa i permet la reactivació de bacils latents locals en finalitzar la seva administració [9]. Aquest fet també explica perquè la quimioteràpia s’ha d’administrar tant de temps.


5.-L’origen de RUTI

El disseny de RUTI sorgeix per superar la immunodepressió generada per una quimioteràpia de curta duració contra LTBI (Figura 1). RUTI es capaç de reestimular la immunitat preexistent, majoritàriament centrada contra el bacils en creixement, així com iniciant una resposta contra antígens estructurals o induïts per estrès, presents als bacils latents.
El procés de fabricació de RUTI es va publicar recentment [10]. Actualment Archivel Farma s.l. (Mataró) el fabrica en condicions de Bones Pràctiques de Manufactura (BPMs). El procés implica el cultiu de M. tuberculosis durant 3 setmanes en agar Middlebrook 7H11, a 37ºC sota una atmosfera progressiva de disminució en el pH i pO2. Un cop s’obtenen les colònies, es fragmenten mecànicament utilitzant boles de silica-zirconi en PBS amb un 4% de Tritó X-114. Després d’una lleu centrifugació a 3000 g per treure les cèl.lules senceres, el pelet es centrifuga a 27.000 g, extraient-se el sobrenedant. Després del rentat, el pelet es pasteuritza a 65ºC durant 40 minuts, i es liposoma. La composició peptídica de RUTI es determina utilitzant SDS-PAGE, i el patró s’obté mitjançant western blot, tal com s’ha descrit prèviament [10].


6.-Mecanismes de protecció i efectivitat de RUTI

La inoculació de RUTI en ratolins infectats i tractats durant un període curt de quimioteràpia indueix una forta resposta immune de tipus Th1/Th2/Th3 contra 13 antígens de M. tuberculosis, que permet una forta acumulació (fins a 10 vegades) de cèl.lules T PPD-específiques de tipus CD4 i CD8 en el pulmó infectat, en comparació amb aquells animals només tractats amb quimioteràpia (Figura 2)[8]. Cal remarca que la immunoteràpia amb BCG només aconsegueix incrementar significativament el reclutament de cèl.lules T CD4.
Per un altre cantó, la serumteràpia passiva amb anticossos policlonals obtinguts a partir de ratolins tractats durant un curt període de quimioteràpia i RUTI, era capaç de controlar la reactivació de ratolins SCID tractats durant un curt període de quimioteràpia (Figura 3), demostrant el paper protector de la resposta humoral generada per RUTI [12].

L’eficàcia de RUTI s’ha pogut demostrar en una ampla gamma de soques de ratolins. Alguns d’aquests experiments ja estan publicats [11]. La Figura 4 mostra un experiment estàndard, reflexant no tan sols el control de la reactivació, sinó l’efecte bactericida induït per la immunoteràpia amb RUTI. Aquest efecte s’ha pogut demostrar també en conills porquins, tal com es reflexa a la Figura 5. En aquest model és especialment difícil reflexar l’efecte bactericida, donat que els conills porquins control millor que els ratolins la concentració bacil.lar. Els experiments de llarga evolució (24 setmanes d’evolució) no mostren diferències quant a les concentracions bacil.lars, en comparació amb els controls. En aquest cas les diferències s’obtenen quan a la supervivència dels animals i el grau de severitat de la patologia pulmonar, que es controla millor en els animals tractats amb RUTI.

Aquest efecte també es va demostrar en cabres naturalment infectades amb M. bovis (Figura 6) (no publicat). Dades obtingudes a partir d’un estudi de camp varen reflexar aquest benefici en els animals tractats amb RUTI.
En aquests animals, la quimioteràpia de curta duració reduïa dramàticament l’afectació pulmonar i extrapulmonar. La combinació d’aquest tractament amb la inoculació de RUTI va provocar també la disminució de la patologia en els nòduls limfàtics hiliars, quelcom primordial en el tractament de la LTBI humana (Figura 7).
A més, la immunoteràpia amb RUTI va induir l’augment d’ IFN-g en sang perifèrica post-estimulació ex-vivo amb ESAT-6, PPD-boví i RUTI (Figura 8). La inoculació de RUTI va induir un augment transitori de la temperatura rectal (1ºC, 24 hores després de la inoculació) i una tumefacció local com a conseqüència d’una reacció granulomatosa. No hi va haver ni toxicitat sistèmica ni mortalitat induida per la inoculació de RUTI. El cultiu de les mostres dels nòduls limfàtics hiliars va desmostrar un promig de 2 log10 CFUs en tots els grups experimentals.


7.- Conclusions

Una vegada demostrada l'utilitat de RUTI en el control del bacil latent en els assajos preclínics (incloent l'absència de toxicitat en el tractament), s'ha iniciat un desenvolupament clínic amb la finalitat de demostrar la utilitat d'escurçar el tractament de la LTBI de 9 a 1 mes afegint la vacunació terapèutica amb RUTI al final. L'assaig de fase 1 s'iniciarà al finals de l'any 2006.


REFERENCIES

1. World Health Organization. Global Tuberculosis Control. WHO Report 2001. Geneva, Switzerland, WHO/CDS/TB/2001.287.
2. Mitchison DA. Basic mechanisms of chemotherapy. Chest 1979; 76S; 771-775S.
3. Grosset J. Bacteriologic basis of short-course chemotherapy for tuberculosis. Clin Chest Med 1980; 1: 231-241.
4. Thoen CO. Tuberculosis in wild and domestic mammals In: Tuberculosis Pathogenesis protection and control Bloom BR. (Ed.). ASM Press Washington DC 1994;11:157-164.
5. Cardona PJ, Llatjós R, Gordillo S,Viñado B, Díaz J, Ariza A, Ausina V, Towards a “human-like” model of tuberculosis: Local inoculation of LPS in lungs of Mycobacterium tuberculosis aerogenically infected mice induces intragranulomatous necrosis. Scand J Immunol 2001; 53: 65-71.
6. North RJ & Jung YJ. Immunity to tuberculosis Annu Rev Immunol 2004;22:599-623
7. Cardona PJ, Gordillo S, Díaz J, Tapia G, Amat I, Pallarés A, Vilaplana C, Ariza A, Ausina V Widespread bronchogenic dissemination makes DBA/2 mice more susceptible than C57BL/6 mice to experimental aerosol infection with Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun. 2003; 71 (10): 5845-5854.
8. Cardona PJ. RUTI: a new chance to shorten the treatment of latent tubeculosis infection. Tuberculosis (Edimb.). 2006. In Press.
9. Cardona PJ, Julian E, Gordillo S, Díaz J, Vallès X, Luquín M, Ausina V. Production of antibodies against glycolipids from the cell wall of M. tuberculosis in a murine model of tuberculosis. Scand J Immunol. 2002; 55: 639-645.
10. Cardona PJ, Amat I. Origin and Development of RUTI, a new therapeutic vaccine against Mycobacterium tuberculosis infection. Arch Bronconeumol 2006; 42:25-32.
11. Cardona PJ, Amat I, Gordillo S, Arcos V, Guirado E, Diaz J, Vilaplana C, Tapia G, Ausina V. Immunotherapy with fragmented Mycobacterium tuberculosis cells increases the effectiveness of chemotherapy against a chronical infection in a murine model of tuberculosis. Vaccine 2005; 23, 1393-1398.
12. Guirado E, Amat I, Gil O, Díaz J, Arcos V, Caceres N, Ausina V, Cardona PJ. Passive serum-therapy with polyclonal antibodies against Mycobacterium tuberculosis protects against post-chemotherapy relapse of tuberculosis infection in SCID mice. Microbes & Infection available online 27 january 2006.

Figure 1. Temporal strategy for the use of RUTI, indicating the effects of short-course chemotherapy and the requirements for subsequent immunotherapy.


Figure 2. Evolution of TCD4+ and TCD8+ IFNg+ cells, stimulated ex vivo with PPD, from lungs of infected mice treated with chemotherapy from weeks 6 to 14, and treated with 2 subcutaneous (s.c.) inoculations of RUTI (245 g) at weeks 14 and 17; 1 s.c. inoculation of BCG (10e6 CFUs) at week 14 or 1 s.c. of empty liposomes (control) -red, greeen and black symbols, respectively. The results are given as mean values with standard deviations obtained from 4 mice for each time point. Differences with control were significant when marked with * for p < 0.05 [8].



Figure 3. Control of CFUs after serum-therapy in the lung of SCID mice. After infection, mice were treated with INH+RIF from week 3 to 8 (in orange), and treated with 4 intraperitoneal (i.p.) inoculations of serum (hyperimmune serum, HS) from mice treated with short-period chemotherapy and RUTI (in red) or from normal non-infected mice (in black). The results are given as mean values with standard deviations obtained from 4 mice for each time point (apart from week 19, where 10 mice were treated with immune serum and 11 mice were given normal serum). Differences with control were significant when marked with * for p < 0.05. [12].



Figure 4. Bactericidal activity of RUTI in the lung of C57BL/6 mice. After infection, mice were treated with INH+RIF from week 9 to 17 (in orange), and with 3 subcutaneous (s.c.) inoculations of RUTI (185 g per inoculation) at weeks 17, 19 and 21 (in red) or empty liposomes (in black). The results are given as mean values with standard deviations obtained from 4 to 6 mice for each time point. Differences with control were significant when marked with * for p < 0.05 [11].



Figure 5. Bactericidal activity of RUTI in the lung of guinea pigs. After infection, animals were treated with INH+RIF from week 4 to 8 (in orange), and with 3 subcutaneous (s.c.) inoculations of RUTI (185 g per inoculation) at weeks 8, 10 and 14 (in red) or empty liposomes (in black).The results are given as mean values with standard deviations obtained from 8 animals for each time point. Differences with control were significant when marked with * for p < 0.05 [8].



Figure 6. Therapeutic diagram of the field study in M.bovis infected goats. Some of the animals were treated with isoniazid (300 mg intramuscular twice a week, in orange) and some of them received 2 inoculations of RUTI (271 g each). Peripheral blood was obtained at different time points to check the production of IFN-g after being stimulated ex vivo with different M. tuberculosis antigens.



Figure 7. Field study in M.bovis infected goats. Pathology scoring values (adapted from Vordermeier et al IAI 2002) reflects the control of the pathology induced by RUTI therapy in the hilar lymph nodes compared with the only chemotherapy treatment (Picture A). Chemotherapy treatment clearly induce a control of the infection, as reflected in the pathology scoring in pulmonary and extrapulmonary sites (Picture B).



Figure 8. Field study in M.bovis infected goats. Production of IFN-g after ex vivo stimulation of peripheral blood with ESAT-6. Picture A reflects individual monitoring of each animal. Picture B shows the ratios between weeks to check the tendency of the values (<1 decrease; >1 increase). Orange box shows the chemotherapy period and blue arrows RUTI inoculation.